肝细胞担任肝净的次要代谢功能。为了为这些心理勾当供给能量，肝细胞接收和操纵大量的脂质，包罗逛离脂肪酸和脂卵白物。肝细胞是肝净中储存甘油三酯的次要细胞，也是MASLD中堆集脂质的细胞。正在MASLD患者中，脂质的摄取和合成跨越了通过耗损和分泌的通量，导致肝细胞中脂质过度堆积，最终细胞脂毒性。脂毒性是MASLD和MASH的次要要素之一，其特征是正在肝细胞的细胞质中堆集有毒脂质，导致细胞器功能妨碍、细胞毁伤，最终导致脂肪细胞凋亡。

　　糊口体例的改变，如饮食干涉和活动锻炼，仍然是MASLD患者的焦点。然而，对糊口体例改变的顺从性差是办理MASLD的一个严沉挑和，使得药物医治对于医治MASLD及其进展阶段MASH变得不成或缺。然而，目前尚无特地针对MASLD和MASH患者的核准药物。包罗胰高血糖素样肽-1受体冲动剂、核受体激活剂（例如，elafibranor和GFT505）和胰岛素增敏剂（例如，glitazones，metformin）正在内的几种药物仍正在MASH的药物研发管线中。因而，针对进展性MASH的医治药物开辟存正在未满脚的医疗需求。保守中药（TCM）因其为医治MASH供给更多的选择而遭到越来越多的关心。水飞蓟素（Sily）通过多种路子减轻MASH，包罗调理脂质代谢、抗炎和抗氧化应激。值得留意的是，水飞蓟素已注册用于针对MASH医治的4期临床试验。因而，水飞蓟素正在本研究中被用做阳性对照药物。

　　我们团队之前的研究发觉苏木酮A能够急性肝毁伤中的肝净炎症和肝纤维化。正在本尝试中，我们初次苏木酮A减轻了受损小鼠肝净中巨噬细胞的浸湿，并了M1型巨噬细胞的极化。此外，受损小鼠肝净中肝净TNFα、IL - 1β和IL - 6的表达升高。MASH小鼠肝净中CCL2和CXCL10的表达表示出不异的趋向。值得留意的是，苏木酮A降低了MASH小鼠中这些肝净炎症因子。然而，苏木酮A正在MASH中的抗炎感化尚未研究，这形成了本研究的局限性。因而，需要进一步的研究来更清晰地阐明苏木酮A正在KCs中取MASH相关的肝净炎症中的感化。

　　非常的肝净胶原卵白堆集会导致肝净纤维化、生硬和终末期肝病，这些是MASH最常见的致命肝净后果。防止肝净纤维化是为医治MASH而设想的现代医治方案的方针之一。随后，我们确定苏木酮A能否对MASH肝净具有抗纤维化感化。

　　次要尿卵白（Mups）是一种载脂卵白，它们具有保守的β-布局，使其可以或许做为各类疏水配体的转运卵白，包罗类固醇激素、消息素和脂质。Mups次要正在肝净中表达并到尿液中。分泌到尿液中的Mups做为消息素参取嗅觉交换，而体内轮回的Mups被认为正在脂质运输和外源性解毒中起着主要感化。迄今为止，很多研究曾经Mups做为载脂卵白参取肝净脂质稳态。正在遗传性和饮食的肥胖和糖尿病以及能量摄入削减的环境下，Mup1或Mup5的表达和血浆含量显著降低。此外，Mup1能够通过其疏水布局取棕榈酸（PA）连系，并改善线粒体功能妨碍。此外，正在糖尿病模子中，弥补沉组Mup1显著降低了高血糖。察看到正在低密度脂卵白受体缺陷小鼠中Mup19的表达下调，而正在赐与低脂高碳水化合物饮食的小鼠中表达下调，而正在喂食颗粒饲料的小鼠中表达添加，表白Mup19可能有帮于脂质代谢。Mup3取其他Mup家族具有类似的功能，并有帮于脂质代谢。因而，Mups可能做为减轻MASLD或MASH的有但愿的医治靶点。

　　正在本研究中，我们证了然苏木酮A至多部门通过上调肝细胞中Mup3的表达来减轻MASH。然而，组测序中受苏木酮A影响的前20个堆叠基因，包罗Semaphorin 3b（Sema3B）、GIPC PDZ布局域含家族2（Gipc2）以及CD63，可能正在MASH进展中阐扬感化。比来的一项研究发觉，Sema3B通过推进M2 - 巨噬细胞极化削减促炎细胞因子的排泄，正在骨关节炎模子中阐扬感化。相反，先前的一项研究演讲称Sema3B能够推进IL - 18的发生并添加肿瘤微中M1 - 巨噬细胞的募集。已有文献记录Gipc2参取肿瘤细胞凋亡和免疫细胞浸湿。CD63，也称为溶酶体相关膜卵白3。CD63敲低了RAB37介导的人脂肪源性间充质干细胞的脂肪生成分化。除了介导脂肪生成外，CD63还可以或许调理凋亡。CD63的表达阻断了人肾小管上皮细胞的细胞凋亡。因为这些成果表白这三个基因参取了MASH的进展，我们进一步验证了Sema3B、Gipc2和CD63的基因表达正在MASH模子中显著上调，但正在苏木酮A给药后降低。然而，这三个基因感化的具体机制尚未摸索，这代表了本研究的局限性。因而，后续研究应进行以摸索Sema3B、Gipc2和CD63正在MASH发病机制中的具体感化。此外，MAPK信号通被PharmMapper办事器预测为苏木酮A的潜正在靶向通。我们的数据还显示MAPK通正在MASH小鼠肝净中被激活，而苏木酮A医治改变了这一趋向，表白苏木酮A供给的肝可能部门通过调理MAPK信号通实现。

　　如图6A和B所示，西瑞红染色显示，正在MCD + 苏木酮A处置的小鼠中，肝净纤维化有显著改善，其纤维间隔比接管载体处置的MCD喂养小鼠更窄。GSEA进一步了苏木酮A医治加强了胶原卵白代谢过程（图6C）。同样，DEGs的热图也进一步了苏木酮A的抗纤维化效应（图6D）。分歧地，苏木酮A医治减轻了纤维化组织中促纤维化基因的表达，包罗α - 滑润肌肌动卵白（αSMA）、Ⅰ型胶原卵白（Col1）、Ⅳ型胶原卵白（Col4）、金属卵白酶 - 1（TIMP1）和发展因子- β（TGFβ）（图6E）。总体而言，苏木酮A正在MASH小鼠中表示出抗纤维化特征。

　　此外，正在MCD + 苏木酮A取MCD比拟，有249个DEGs下调，199个DEGs上调（图3E）。基于这201个堆叠的DEGs进行了KEGG、GO和GSEA阐发。正在NC和MCD组的比力中，GO术语次要映照到脂质代谢过程、免疫系统过程和胶原纤维组织，而KEGG术语映照到PI3K - Akt、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和MAPK路子（图3F）。相反，正在MCD和MCD + 苏木酮A组之间，GO术语次要取脂质代谢过程、免疫系统过程、细胞外基质（ECM）和胰岛素受体活性相关，而KEGG术语则集中正在PPAR信号通和炎症相关路子上（图3G）。

　　代谢功能妨碍相关脂肪性肝炎（MASH）是一种炎症性脂毒性紊乱，其特征是肝净脂肪变性、肝细胞毁伤、炎症以及分歧程度的纤维化。苏木酮A（SA）是一种黄酮类化合物，具有抗炎和保肝活性。然而，SA对MASH的影响尚不明白。我们评估了SA对MASH小鼠肝细胞脂毒性、炎症和纤维化情况的影响，以及其潜正在的感化机制。

　　包罗肝细胞脂毒性、氧化应激、胰岛素抵当和肠道菌群失调正在内的浩繁要素促成了肝净炎症反映。肝净巨噬细胞，包罗浸湿的单核细胞衍生巨噬细胞和驻留的库普弗细胞（KCs），已被确定正在MASH的炎症过程中阐扬环节感化。巨噬细胞极化是影响MASH进展的环节要素，M1和M2代表巨噬细胞的两种极化形态，别离通过促炎和抗炎活性正在体内维持稳态。MASH患者促炎细胞因子和趋化因子程度升高。TNFα、IL - 1β和IL - 6等促炎细胞因子正在MASH的布景下阐扬多种感化。这些细胞因子的排泄耽误了免疫反映，并推进了中性粒细胞和巨噬细胞向毁伤部位的弥补。这一过程加剧了炎症反映，并构成了恶性轮回。此外，某些细胞因子HSCs分化成发生大量细胞外基质的肌成纤维细胞，最终导致纤维化。此外，这些细胞因子正在放大脂肪组织内的炎症级联反映中起着环节感化，从而导致胰岛素抵当并推进脂质堆集。趋化因子，包罗CCL2和CXCL10，正在MASH中加剧炎症和纤维化，并推进免疫细胞的肝净浸湿。

　　苏木酮A（SA），是一种从Caesalpinia sappan Linn。中提取的生物活性同型异黄烷酮，具有多种药理感化，如抗炎和抗氧化活性。先前的研究表白，SA通过糖尿病小鼠中的NF-κB信号通减轻肾净炎症和纤维化。此外，SA减轻了脑缺血再灌注毁伤小鼠模子中内质网（ER）应激惹起的炎症和氧化应激毁伤。我们先前的研究进一步表白，SA通过调理小鼠中M2型巨噬细胞极化减轻了四氯化碳的肝纤维化。然而，SA防止MASH的潜正在机制尚不清晰。鉴于MASH以肝净脂肪变性、炎症和纤维化为特征，我们假设SA可能正在办理MASH方面阐扬积极感化。因而，本研究操纵体内MASH小鼠模子和体外脂毒性模子来探究SA的药理感化。此外，还对小鼠肝净组织进行了mRNA测序阐发，以阐明SA的相关感化靶点或路子。我们的研究可能会加强对SA匹敌MASH机制的理解。

　　如图5A和B所示，取对照组比拟，正在MCD喂养小鼠中察看到脂肪生成相关基因表达升高以及脂肪酸β - 氧化相关基因表达降低，而苏木酮A医治逆转了这些效应。此外，苏木酮A医治显著添加了脂肪酸分化相关基因的表达，包罗细胞色素P450（Cyp）2e1、Cyp3a11和Cyp4a10，正在MASH模子中（图5C）。同样，DEGs的热图进一步了苏木酮A对MCD饮食的脂肪变性的效应（图5D）。因而，这些发觉表白苏木酮A肝净脂质合成并推进脂质代谢，从而减轻MASH的严沉程度。

　　成果：计较机预测表白SA可以或许调理炎症、胰岛素抵当、脂质代谢和胶原卵白分化过程。SA剂量依赖性地降低了饮食的MASH小鼠血清中ALT和AST的升高程度，且高剂量SA医治的结果取水飞蓟素雷同。此外，SA医治显著削减了代谢应激下脂质堆积、炎症和纤维化的程度，且呈剂量依赖性。别的，肝净组学进一步了上述发觉。值得留意的是，mRNA测序阐发和生物学尝试表白，SA显著上调了肝净中次要尿卵白3（Mup3）的表达，从而推进脂质运输并脂毒性。此外，正在肝细胞中敲低Mup3显著消弭了SA供给的肝感化。

　　鉴于脂质代谢过程正在MASH病理心理学中的环节感化，我们接下来验证了苏木酮A医治能否影响MCD喂养小鼠的脂质代谢。切片的油红O染色证明，正在赐与中高剂量苏木酮A后，MCD喂养小鼠肝净中非常的脂滴堆集显著改善（图4A和B）。分歧地，肝净TG和TC含量也表示出雷同模式（图4C和D）。然而，低浓度苏木酮A对削减脂质堆集没有显著影响。取MCD组比拟，GSEA表白苏木酮A医治了肝净脂质储存、脂质生物合成过程（图4E和F）。

　　方式：采用保守的小鼠MASH模子，即喂食MCD饮食的小鼠，来评估SA正在体内对MASH的感化。通过药物靶点预测和肝净组学来阐明SA的潜正在感化。AML12细胞被用于进一步摸索SA正在体外的结果和机制。

　　如前所述，小鼠分组并给药如图2A所示。记实了每只动物的肝净分量或体沉（图1A和2B - C）。取对照组比拟，MCD喂养组的体沉和肝净分量均有所下降。然而，苏木酮A医治部门逆转了这些效应并改善了它们。此外，中高剂量苏木酮A医治组的体沉和肝净质量取水飞蓟素医治小鼠相当（图2B和C）。虽然如斯，苏木酮A医治并未影响MCD喂养小鼠的肝净指数（图2D）。为了评估苏木酮A对肝功能的影响，通过收集小鼠的血清样本丈量了血清ALT和AST程度。我们察看到苏木酮A剂量依赖性地减轻了MASH小鼠的肝净毁伤，高剂量苏木酮A医治小鼠的医治结果取水飞蓟素医治小鼠类似（图2E）。组织学（H&E）染色切片证明，中高剂量苏木酮A给药后，MCD喂养小鼠肝净中MASH的严沉程度显著减轻（图1F）。如图1G所示，中高剂量苏木酮A的打针显著改善了肝净组织中的脂肪变性程度、NAFLD勾当评分和肝净微炎症，分歧地，苏木酮A医治削减了MASH肝净中的肝细胞灭亡（弥补图1B）。因而，苏木酮A对MCD的小鼠肝净毁伤具有肝感化。

　　正在阳性对照（NC，ND处置组）、苏木酮A（100 mg/kg）、MCD和MCD + 苏木酮A（100 mg/kg）组中，共判定出15988个堆叠基因（图3A）。此外，正在NC取MCD以及MCD取MCD + 苏木酮A组之间筛选出201个配合的差别表达基因（DEGs）（logFC = 1，p adjust 0。05）（图3B）。从成分阐发（PCA）显示分歧组之间有较着的分手（图3C）。此外，火山图显示取NC比拟，MCD中有376个下调的DEGs和493个上调的DEGs（图3D）。

　　载脂卵白正在脂质运输中起着环节感化。它们的次要功能是做为脂卵白的布局成分，推进脂质通过血液和淋巴的运输。当载脂卵白功能受限时，肝细胞内的脂质稳态会发生变化，导致肝净毁伤。因而，调理肝细胞中的脂质运输能够调理脂毒性的发生，并进一步影响MASH的进展。

　　我们发觉苏木酮A医治减轻了MASH模子中的这些肝净并发症（图4-7）。水飞蓟素已被证明能够障碍MASH的进展。高剂量苏木酮A医治表示出取水飞蓟素类似的结果（图2、4和6），这表白苏木酮A具有做为MASH医治选择的潜力。正在本研究中，我们发觉苏木酮A无效地了肝细胞中的脂质堆集和脂毒性，至多部门是通过靶向Mup3，从而小鼠中MASH的成长。本研究的新鲜之处正在于摸索了苏木酮A及其正在MASH小鼠模子中可能的机制，为寻找无效的医治药物供给了新的看法。

　　虽然目前MASH的发病机制尚不成预测，但正在MASH的成长过程中，涉及的一个环节事务是由肝细胞中大量脂质堆积惹起的脂毒性。当肝细胞无法通过将多余的逛离脂肪酸（FFAs）包拆成甘油三酯（TG）来办理这些额外的脂肪酸时，就会发生脂毒性，凡是会导致脂肪细胞凋亡。正在这种环境下，脂毒性期间受损的肝细胞会排泄各类因子，包罗细胞因子和趋化因子，间接刺激肝净中的驻留或轮回巨噬细胞、窦状内皮细胞和肝星状细胞（HSCs），以及招募其他免疫细胞类型。正在分歧肝内细胞类型彼此感化的布景下，持续的肝净炎症反映和过多的纤维堆集会导致肝纤维化以至肝软化。响应地，肝内细胞通过进行的彼此交换将脂毒性取炎症和纤维化联系起来，从而推进MASH的成长。

　　Mups做为一种脂质载体卵白超家族，被认为正在运输亲脂性和调理细胞稳态方面具有双沉功能。值得留意的是，Mups正在介导这些脂质的运输中起着主要感化。研究表白，用沉组Mup1医治雄性糖尿病小鼠可降低血清甘油三酯和胰岛素程度，并削减骨骼肌中的脂质堆集。分歧地，AM251，一种CB1R拮抗剂，通过正在肝细胞中发生Mup1，减轻了逛离脂肪酸的胰岛素信号磷酸化的毁伤。值得留意的是，包罗Mup3正在内的几种Mups正在MASLD小鼠的血清和肝净组织中削减，而Mups弥补显著减轻了疾病前提下的内质网应激和胰岛素抵当。从我们的发觉中留意到，敲低肝细胞中Mup3的表达显著加剧了脂质堆积。Zhx2被发觉是Mup3的环节调理因子，我们验证了正在MASH小鼠模子中，苏木酮A医治后Zhx2的表达添加。这一察看取Mup3的表达程度分歧，进一步了Mup3信号正在介导苏木酮A的肝中的感化。

　　总之，我们的数据描画了苏木酮A做为MASH剂的潜正在功能。如图9K所示，苏木酮A通过上调肝细胞中Mup3的表达脂质堆积，从而削减脂毒性、肝净炎症和纤维化，这导致了MASH进展的减轻。因而，苏木酮A有潜力成为MASH的新型医治剂。

　　为了研究苏木酮A正在肝净炎症中的感化，通过免疫组化染色察看到取对照组比拟，MASH肝净中CD86 + 或F4 / 80 + 巨噬细胞的数量添加，这一现象可通过苏木酮A剂量依赖性地逆转（图7A - D）。qRT - PCR阐发进一步支撑了这些成果（弥补图7A），苏木酮A医治显著降低了相关炎症因子（肿瘤坏死因子α（TNFα）、IL - 1β和IL - 6）的mRNA表达程度（图7E）。正在ELISA中也察看到这些炎症因子的雷同成果（图7F）。此外，苏木酮A医治还降低了MASH中CXCL10正在肝净中的表达程度（弥补图7B）。分歧地，组测序成果显示，正在MCD喂养的小鼠中，苏木酮A医治后炎症反映下调（图7G）。所有这些数据表白苏木酮A能够显著减轻MASH小鼠的肝净炎症反映。

　　为了验证上述猜测，我们利用siRNA缄默AML12肝细胞中Mup3的表达。干扰效率如图9F所示，敲低效率跨越60%。值得留意的是，Mup3敲低部门消弭了苏木酮A供给的脂肪分化效应，这通过脂肪生成基因程度的添加（图9G）以及TG和TC（图9H）获得。此外，Bodipy荧光染色表白，缄默Mup3添加了脂质含量，并削减了苏木酮A对肝细胞脂质构成的影响（图9I - J）。综上所述，这些成果表白Mup3对于苏木酮A的肝细胞中脂质堆集的是必不成少的。

　　通过PharmMapper办事器预测了苏木酮A的潜正在靶卵白。然后，正在DAVID数据库中对GO和KEGG术语进行了富集。GO术语次要包罗胶原卵白分化过程、对脂多糖的响应、胰岛素信号通、胆固醇储存的负向调控以及脂肪酸连系（图1E）。KEGG富集术语包罗代谢路子、脂质和动脉粥样软化、胰岛素抵当、丝裂原活化卵白激酶（MAPK）信号通以及IL - 17信号通（图1F）。这些富集术语取脂质代谢、炎症和纤维生成亲近相关，表白苏木酮A可能对MASH的进展具有延缓感化。

　　MASH的肝净表示包罗代谢功能妨碍和肝净病理之间的复杂彼此感化，涉及肝净脂肪变性、正在本研究中，数据显示了MASH小鼠较着的肝净并发症，包罗肝净脂肪变性和脂肪生成（图4和5）、肝净纤维化（图6）和炎症（图7），这表白成功建立了MASH小鼠模子。然而，针对MASH最无效的药物疗法仍然难以捉摸。吡格列酮是APASL保举的特定疗法之一，改善了MASH患者的肝净组织病理学，包罗肝净脂肪变性、气球样坏死和炎症。因而，针对进展性MASH的医治药物开辟存正在未满脚的医疗需求。

　　为了摸索苏木酮A调理MASH肝净中脂肪分化的机制，进行了组测序阐发。筛选出NC取MCD组以及MCD取MCD + 苏木酮A组之间差别最显著的前20个堆叠的DEGs。风趣的是，载脂卵白Mup3的表达程度正在MASH肝净中显著降低，而苏木酮A医治恢复了这一变化（图9A）。Western blot也了不异的模式（图9B和C）。我们进一步查抄了锌指和同源盒2（Zhx2）的表达程度，Zhx2是Mup3的环节调理因子（Jiang等，2017），发觉经苏木酮A医治的MCD处置组中Zhx2表达添加（图9D），这取Mup3的表达分歧，进一步了Mup3信号通。此外，PA降低的Mup3表达正在肝细胞中部门被苏木酮A医治逆转（图9E）。按照这些察看，我们猜测苏木酮A的抗脂肪肝效应可能是通过靶向Mup3实现的。

　　为了进一步确认苏木酮A能否能够间接削减肝细胞中的脂质堆集，利用PA建立了一个别外脂毒性模子。取对照小鼠比拟，模子小鼠中察看到的升高的LDH含量反映了PA的脂毒性，而苏木酮A（10和100μM）医治改善了PA的细胞毁伤（图8A）。我们还利用Bodipy荧光染料来展现细胞内脂质含量，发觉苏木酮A医治减轻了PA正在肝细胞中发生的过度脂质堆积（图8B和C）。此外，苏木酮A还降低了PA处置的肝细胞中的TG和TC程度（图8D）。值得留意的是，相关脂肪生成基因的mRNA表达程度也表示出雷同模式（图8E）。因而，这些发觉表白苏木酮A能够间接代谢功能妨碍下的肝细胞中的脂肪生成。

　　代谢功能妨碍相关脂肪性肝炎（MASH，原称NASH），是代谢功能妨碍相关脂肪性肝病（MASLD，原称NAFLD）的晚期形式，其特征是肝净脂肪变性、炎症和进行性纤维化。它可能会成长为肝软化和肝癌，虽然正在临床上常常是无症状的。据估量，通俗人群中MASLD的全球患病率约为30%，而且仍正在以惊人的速度上升。然而，迄今为止，尚无核准的针对MASH及其并发症的无效医治方式。因而，火急需要开辟针对这种高发疾病的无效医治策略。